Forschung

Lehrstuhl für Chemie Biogener Rohstoffe (Prof. Dr. Volker Sieber)

Die heutige Chemieproduktion basiert fast ausschließlich auf Erdöl und Erdgas als Rohstoff. Im Zuge einer nachhaltigeren Wirtschaftsweise ist es wesentlich, Grundchemikalien zunehmend aus nachwachsenden Rohstoffen, d. h. aus Biomasse herzustellen und so die Basis einer neuen „grünen“ Chemie zu schaffen. Ziel der Arbeiten am Lehrstuhl ist es, technische Prozesse zu entwickeln, die es erlauben, etablierte Grundstoffe für die Chemieproduktion und Feinchemikalien effizient und damit wirtschaftlich aus Biomasse herzustellen sowie neue relevante Stoffe zu etablieren, die aus nachwachsenden Rohstoffen gewonnen werden können.

Forschungsgebiete

Biomasseaufschluss und Fermentation

Biogene Rohstoffe enthalten in der Regel eine Vielzahl verschiedener Inhaltstoffe. Um aus Ihnen Grundstoffe für eine zukünftige industrielle Nutzung zu gewinnen, müssen die Biomassen zunächst geeignet aufbereitet, und, je nach gewünschten Inhaltstoffen, fraktioniert werden. Diese können dann über chemische und/oder biotechnologische Wege weiter umgesetzt werden, um petrochemische Produkte zu substituieren oder neue funktionelle Stoffe zu synthetisieren.

Der Forschungsbereich „Biomasseaufschluss & Fermentation“ beschäftigt sich sowohl mit der Entwicklung von Prozessen zur gezielten Aufbereitung von biogenen Roh- und Reststoffen, als auch mit der Entwicklung  biobasierter Prozesse zur Umsetzung von Inhaltstoffen zu werthaltigen Grundstoffen für die chemische Industrie oder zu Energieträgern.

Schwerpunkte der F&E-Arbeiten bilden der Aufschluss und die Fraktionierung von Lignocellulose haltigen Roh- und Reststoffen mit dem Ziel der Entwicklung von Bioraffineriesystemen zur möglichst vollständigen Nutzung der Rohstoffe. Ebenso stehen Mikroalgen im Fokus. Methodisch kommen mechanische, physikalisch-chemische (thermische Hydrolyse) und chemische Aufschlussverfahren in Kombination mit biotechnologischen (enzymatischen) Verfahren zu Einsatz. Zur Identifizierung von Inhaltstoffen oder Aufschlussprodukten werden geeignete analytische Verfahren entwickelt bzw. angepasst. Mittels einer am Lehrstuhl weiterentwickelten GC-MS-basierten Analysemethode können beispielsweise ligninstämmige phenolische Inhibitoren zuverlässig identifiziert und quantifiziert werden.

Bei der Entwicklung von Biokonversions- und Fermentationsprozessen liegt ein Schwerpunkt auf der Umsetzung von Sacchariden in Lignocellulosehydrolysaten. Aktivitäten zur Biogastechnologie betreffen Methoden zur Verbesserung des hydrolytischen Biomasseaufschlusses sowie zur Optimierung der Effizienz der Prozessbiologie.

Transformationen für nachwachsende Rohstoffe

Die heutige Chemieproduktion basiert immer noch weitgehend auf den Rohstoffen Erdöl und Erdgas. Deren begrenzte Verfügbarkeit erfordert die Nutzung von nachwachsenden Rohstoffen und zugleich entsprechende Forschung zur Erweiterung der derzeitigen Nutzungsmöglichkeiten. Aufgrund dieser Tatsache, ist der Ersatz des Rohstoffs Öl in der Produktion von Grund- und Feinchemikalien eine der zentralen Herausforderungen für die Chemie des 21. Jahrhunderts. Für den Rohstoffwandel werden umweltfreundliche, effiziente und wirtschaftliche Prozesse auf der Basis neuer Synthesemethoden und –strategien benötigt. Wir widmen uns diesem Forschungsfeld, wobei der Fokus auf chemischen und enzymatischen Synthesemethoden und der Kombination beider liegt.

Unser Ziel ist es neue Methoden zu schaffen und diese zu technischen Prozessen für die effiziente und wirtschaftliche Synthese von Grund- und Feinchemikalien weiterzuentwickeln. Um das zu erreichen, bedienen wir uns des synthetischen Arsenals der organischen und anorganischen Chemiker und auch im Supermarkt von Mutter Natur. Eigenschaften, die wir dort nicht finden, werden durch die Anwendung von Methoden der Proteinevolution und des Enzym Engineering und durch Werkzeuge zur Kombination von chemischen und biochemischen Katalysatoren durch unsere eigenen Hände erzeugt.

Chemoenzymatische Synthese

Einsatz von Biokatalysatoren und organischen / anorganischen Katalysatoren zur Synthese von Grund- und Feinchemikalien aus nachwachsenden Rohstoffen.

Es existiert eine Fülle an organisch- und anorganisch-chemischen Katalysatoren, die eine außergewöhnliche Vielfalt und Komplexität aber auch Selektivität in den von ihnen katalysierten Reaktionen aufweisen. Dennoch fehlt ihnen im Allgemeinen Kompatibilität mit Enzymen und biogenen Substraten und den dazugehörigen Lösemitteln. Auf dieser Basis erforschen wir chemo-enzymatische Prozesse für die effiziente und zielgerichtete Umsetzung von komplexen biogenen Rohstoffen. Wir arbeiten daran die Kombination verschiedener Katalysatoren zu ermöglichen, um den Rohstoffwandel in der Chemikalienproduktion voranzubringen.
Der wachsende Bedarf nach neuen Katalyse-Strategien zur Umsetzung von biogenen Substraten führt zu einer verstärkten Forschung hinsichtlich der kombinierten Anwendung von Bio- und Chemokatalyse. Wir haben uns bisher auf die Kombination von chemischer Oxidation durch molekularen Sauerstoff mit biokatalytischen Dehydratisierungsreaktionen konzentriert. Als Beispiel konnten vier verschiedene 2-Keto-3-desoxy Zuckersäuren durch die Kombinationen eines Goldkatalysators, der in einem kontinuierlichen Reaktor zurückgehalten wurde, mit einer immobilisierten Dehydratase erhalten werden.

cbr-chemoenzymatische-synthese

Aktuell arbeiten wir an weiteren chemo-enzymatischen Syntheseansätzen, die zu anderen Produkten führen und die noch weitere Reaktionsschritte beinhalten. Zudem entwickeln wir auch neue Strategien für die Kombination von Katalysatoren in Kompartimenten auf der Basis kontinuierlicher Systeme.

Enzym Engineering

cbr-enzym-engineeringDie Natur beschenkt uns mit einer Vielfalt von Katalysatoren, die alle intrinsisch die Fähigkeit besitzen biogene Substrate umwandeln zu können – die Enzyme. Ansätze für die Umwandlung von Biomasse in Grund- und Feinchemikalien erfordern aber biochemische Parameter, die sich signifikant von denen in den natürlichen Habitaten der Enzyme unterscheiden. Die Enzyme müssen sowohl untereinander kompatibel sein, aber auch mit allen auftretenden Intermediaten und auch mit hohen Produktkonzentrationen fertig werden – eine schwierige Aufgabe! Um sie auf diese Aufgabe vorzubereiten und die entsprechenden Biotransformationen zu optimieren müssen wir viele Enzymeigenschaften, wie (Thermo)Stabilität, spezifische Aktivität, Substratspezifität, Cofaktorspezifität und Inhibition (auch durch hohe Produktkonzentrationen) maßschneidern. Unser Fokus liegt hier unter anderem auf der Optimierung von Dehydratasen, Oxidoreduktasen, Hydroxylasen und Aminotransferasen.

Enzym Engineering ist ein wichtiger Teil unserer Forschung, der sich aktuell sehr rasch entwickelt. Wir erforschen neue Werkzeuge für das Enzym Engineering und nutzen diese um verbesserte Katalysatoren für die Produktion von Grund- und Feinchemikalien aus Kohlenhydraten zu erhalten.

Stabilität von Biokatalysatoren

In den Laboren im TUM Zentralinstitut für Katalyseforschung, die seit Anfang 2016 für den Lehrstuhl verfügbar sind, arbeiten wir an enzymkatalytischen Fragestellungen.

In vielen industriellen Prozessen werden heutzutage Biokatalysatoren eingesetzt. Für die Wirtschaftlichkeit solcher Prozesse spielen neben den Katalysator-Herstellungskosten die katalytische Aktivität und auch die katalytische Stabilität der Katalysatoren unter Prozessbedingungen die wichtigste Rolle.

Am Zentralinstitut für Katalyseforschung forschen wir daher an der Stabilitäts-Verbesserung von Biokatalysatoren, um so die Ausbeuten industrierelevanter Prozesse zu steigern. Heutzutage werden unter anderen verschiedene Enzymimmobilisierung-Verfahren zur Erhöhung von Enzymstabilität eingesetzt. Da diese Verfahren aber meist empirisch für jeden Biokatalysator neubestimmt und analysiert werden müssen, sind diese Methoden oft zeitaufwendig und nicht immer erfolgsversprechend. Um diesen Prozess zu vereinfachen, untersuchen wir diese klassischen Verfahren in Bezug auf die Immobilisierung Enzymen ganzer Enzymreaktionskaskaden zur Erstellung von immobilisierten heterogenen Multienzymkomplexen, um so Substrat-Enzym Bindungsaffinitäten aller beteiligten Biokatalysatoren zu erhöhen.

Durch die Verwendung von Methoden zum rationalen Proteindesign soll untersucht werden, wann welche Stabilitätskriterien bzw. Strukturelemente bei welchen Umgebungsparametern wie zum Beispiel in organischen Lösungsmitteln von Bedeutung sind. Hierfür werden Fragestellungen wie zum Beispiel „Welche Verfahren eignen sich zur Stabilitätsverbesserung von Biokatalysatoren?“ und „Können einheitliche Stabilisierungsmaßnahmen abgeleitet werden?“ untersucht.

Metabolic engineering und Mikrobielle Polysaccharide

Biosynthese und Engineering von mikrobiellen Polysacchariden

Basierend auf der hohen genetischen Diversität der Produktionsorganismen stellen mikrobielle Polysaccharide eine multifunktionale Klasse wertvoller biogener Polymere dar. Ihr oftmals komplexer Aufbau macht sie für den Einsatz in einer Vielzahl an (Lebensmittel)technischen und pharmazeutischen Anwendungen interessant. Ziel des Forschungsschwerpunkts ist es, basierend auf einer stetig wachsenden Stammsammlung, neue mikrobielle Exopolysaccharid-Produzenten (Bakterien, filamentöse Pilze) zu identifizieren. Mittels eines am Lehrstuhl selbst entwickelten Hochdurchsatz-Screenings kann die Monomer-Zusammensetzung der gebildeten Polymere bestimmt werden. Genom-Sequenzierungen der neu identifizierten Produktionsstämme, und Ansätze der synthetischen Biotechnologie werden genutzt, um die Biosynthese der einzelnen Polysaccharide aufzuklären, und Ansatzpunkte für enzymatische und in-vivo Modifikationen zu identifizieren. Hierfür werden auch eigens entwickelte Chassisorganismen verwendet welche für die Expression von synthetischen Biosynthesecluster eingesetzt werden. Neben den molekularbiologischen Untersuchungen erfolgt auch eine physikochemische Charakterisierung (Rheologie, Struktur, Molekulargewicht) der Polymere.

Vielversprechende EPS-Produzenten werden dann einer prozesstechnischen Optimierung unterworfen. Hierfür stehen vergleichende Parallelbioreaktoren (8*0,7L) und 2L sowie 15L und 30L Bioreaktoren für einen Scale-up zur Verfügung. Anwendungstests in verschiedenen Bereichen runden die Untersuchungen ab. Mittels Genetic- und Metabolic Engineering werden somit maßgeschneiderte Polymere für spezifische Anwendungen entwickelt.

Abbildung 3: Anhand der identifizierten Gencluster lässt sich die Biosynthese zur EPS-Bildung beschreiben. Die beteiligten Enzyme geben Aufschluss über den Ablauf und erlauben in Zusammenhang mit der Monomerzusammensetzung erste Aussagen über die Aufgaben der einzelnen Enzyme. Somit lassen sich auch erste Zielgene für eine Modifikation identifizieren. (Schmid J, Koenig S, Rühmann B, Rütering M, Sieber V (2014) Biosynthese und Genomik mikrobieller Polysaccharide. Biospektrum 20 (3):288-290. doi:10.1007/s12268-014-0443-0)

Abbildung: Anhand der identifizierten Gencluster lässt sich die Biosynthese zur EPS-Bildung beschreiben. Die beteiligten Enzyme geben Aufschluss über den Ablauf und erlauben in Zusammenhang mit der Monomerzusammensetzung erste Aussagen über die Aufgaben der einzelnen Enzyme. Somit lassen sich auch erste Zielgene für eine Modifikation identifizieren. (Schmid J, Koenig S, Rühmann B, Rütering M, Sieber V (2014) Biosynthese und Genomik mikrobieller Polysaccharide. Biospektrum 20 (3):288-290. doi:10.1007/s12268-014-0443-0)

Entwicklung von neuen Hochdurchsatz-Methoden zur Optimierung von Enzymen

Entwicklung von neuen Hochdurchsatzmethoden zur Optimierung von Enzymen

In der biotechnologischen und chemischen Industrie, sowie in der medizinischen Diagnostik und Therapie werden zunehmend Enzyme verwendet. Sie verbessern herkömmliche oder ermöglichen völlig neue Prozesse und Anwendungen. Diese Möglichkeiten wecken einen großen Bedarf an Enzymen mit neuen oder verbesserten Eigenschaften. Die Optimierung der Enzyme durch rationale oder rechnergestützte Methoden ist trotz großer Fortschritte im letzten Jahrzehnt weiterhin stark limitiert. Ein dagegen recht erfolgreiches Verfahren zum Optimieren von Enzymeigenschaften, ist die gerichtete Evolution von Proteinen. Dabei wird zunächst durch Variation einer oder mehrerer DNA-Sequenzen des entsprechenden Enzyms eine Genbibliothek hergestellt, aus der anschließend durch Selektion oder durch Durchmusterung (Screening) diejenigen Genvarianten isoliert werden, die für Enzymvarianten kodieren, die die gewünschten, optimierten Eigenschaften besitzen. Der Vorteil dieser Vorgehensweise liegt darin, dass keine Informationen über Strukturen der Enzyme, ihre Dynamik oder ihre Wechselwirkungen mit verschiedenen Substraten notwendig sind.

Der Erfolg einer gerichteten Evolution, hängt vor allem von der Qualität der Bibliotheken und von der Effektivität der Selektions- und Durchmusterungsstrategien ab. Die Qualität einer Bibliothek ist durch die darin verfügbare Sequenzvariation bestimmt und hängt weitestgehend von dem Verfahren ab, mit dem die Sequenzvariation gebildet wird. Heutzutage werden hauptsächlich zwei Wege der Sequenzvariierung angewandt: in-vitro DNA-Rekombination und Zufallsmutagenese.

Am Anfang der in-vitro DNA-Rekombination steht ein kleines Repertoire an DNA-Sequenzen, die untereinander sehr ähnlich, aber nicht identisch sind. Die Unterschiede (Mutationen) zwischen den Sequenzen können aus der natürlichen Evolution stammen (family shuflling) oder durch die Kombination von Zufallsmutagenese und Selektion eingeführt worden sein. Sie stellen daher eine Vorauswahl dar und daher verbessern sie zum großen Teil die Enzymeigenschaften oder sind zumindest neutral. Bei der in-vitro DNA-Rekombination wird ein Repertoire an DNA-Sequenzen hergestellt, dessen Varianten neue Kombinationen der im ursprünglichen Repertoire vorhandenen Mutationen enthalten. Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie eine größere Zahl an Positionen in einem Gen gleichzeitig variieren kann und dabei meist günstige Mutationen miteinander verbindet. Der Nachteil hingegen ist, dass sich ein Verfahren der Rekombination immer nur auf Positionen beschränkt, die innerhalb des ursprünglichen Repertoires schon Variationen gezeigt haben und außerdem nur auf die an diesen Positionen vorhandenen Mutationen.

Bei der Zufallsmutagenese dagegen werden völlig neue Mutationen eingebaut. Ihr Vorteil ist, dass an allen Positionen eines Gens alle möglichen Variationen eingebaut werden können, sie sich also nicht auf die Vereinigung schon vorhandener Mutation beschränkt. Zwei Techniken der Einführung von zufälligen Mutationen in ein Gen werden heutzutage fast ausschließlich angewandt: die fehlerhafte PCR und die ortsspezifische (Kassetten-)Mutagenese mittels degenerierter Oligonukleotide.

Die im Moment bei weitem dominierende Methode der ortsunspezifischen Zufallsmutagenese ist die fehlerhafte PCR. Dabei wird das zu mutierende Gen einer PCR unter Verwendung einer thermostabilen Polymerase unterzogen (meist Taq-Polymerase), die abhängig von den Bedingungen der Reaktion einzelne Basen falsch in die synthetisierten Gene einbaut. Eine häufige Variante dieser Methode beinhaltet die Verwendung von Mangan(II)-Ionen oder von Nukleotidanaloga im PCR-Ansatz. Diese Methode ist sehr preiswert und einfach durchzuführen. Dennoch hat sie die folgenden, einschneidenden Nachteile:

1. Durch die Beschaffenheit des genetischen Codes – drei Nukleotide kodieren eine Aminosäure, jede Aminosäure wird durch bis zu 6 verschiedene Codons kodiert – lassen sich aus einzelnen Nukleotidaustauschen durchschnittlich nur 6 neue Aminosäuren erreichen. Viele Aminosäureaustausche sind nur durch zwei und manche gar nur durch drei Nukleotidaustausche möglich. Zum Beispiel kann ein Codon für Isoleucin (ATT, ATA oder ATC) nur durch zwei Nukleotidaustausche aus dem Codon CAA für Glutamin und nur durch drei Austausche aus dem Codon CAG für Glutamin gebildet werden. Beispiele aus der Anwendung von Mutagenese zur Verbesserung von Enzymen belegen, dass Varianten mit den geforderten Eigenschaften oft tatsächlich nur durch Triplettaustausche, also Austausche aller drei Nukleotide eines Codons erhalten werden können. Ein Repertoire an Varianten eines Proteins, bei dem an allen Positionen alle möglichen Aminosäuren einzeln ausgetauscht vorkommen, muss, wenn es durch einzelne Nukleotidaustausche (z. B. fehlerhafte PCR) erhalten wurde, sehr groß sein. Ein durchschnittliches Protein von 300 Aminosäuren Länge hat genau 300 × 19 = 5700 verschiedene Varianten, die sich in einer Aminosäure von ihm unterscheiden. Ein Repertoire an Varianten dieses Proteins, was durch durchschnittlich drei Nukleotidaustausche erhalten wurde, hat dagegen (900 × 3)^3 = 2 × 1010 unterschiedliche Varianten. Eine derartige Zahl an Varianten kann nur von den wenigsten Selektionsmethoden behandelt werden. Die Methode der fehlerhaften PCR zur Mutagenese kann daher nicht eingesetzt werden, um vollständige bzw. hochqualitative Repertoires eines Proteins zu erhalten.

2. Bei der fehlerhaften PCR werden nicht alle Nukleotide gleichermaßen ausgetauscht. Es kommt in unterschiedlicher Frequenz zu Transversionen und Transitionen, manche Mutationen treten so viel häufiger auf, als andere. Hierdurch wird eine weitere Verkleinerung der effektiven Größe eines durch fehlerhafte PCR gewonnen Repertoires eingeführt.

3. Durch die hohe Redundanz der Codons – mehrere Codons kodieren für die selbe Aminosäure – kommt es beim Austausch einzelner Nukleotide durchschnittlich zu 23% zu synonymen Mutationen, bei denen das mutierte Codon für die selbe Aminosäure kodiert, wie das ursprüngliche. Zwar können diese Mutationen zu günstigen Veränderungen bei der Expression von Protein führen, wichtige intrinsische Eigenschaften eines Proteins, wie z. B. seine enzymatische Aktivität oder Stabilität bleiben dabei aber unbeeinflusst und somit wird die effektive Größe eines Repertoires herabgesetzt.

4. Im Durchschnitt werden durch 4% aller Nukleotidaustausche Stopcodons eingeführt.

Wenn die Mutageneserate hoch gewählt wird, um eine ausreichend hohe Zahl an Aminosäureaustauschen zu erhalten, so können dadurch eine große Zahl an Stopcodons eingeführt werden, was zu abgekürzten Genprodukten führt. Bei einer durchschnittlichen Mutationsrate von nur 3 Austauschen pro Gen, die theoretisch notwendig ist, um wenigstens an einer Position alle möglichen Aminosäuren einzuwechseln, sind schon über 10% des Repertoires durch vorzeitige Stopcodons verkürzt [1-(1-0.04)^3] = 0.115.

5. Der Einbau von Mutationen ist ein weitgehend statistischer Prozess, bei dem die Anzahl der Mutationen in den einzelnen Varianten einer Poissonverteilung folgt. Dadurch können abhängig von der durchschnittlichen Mutationsrate erhebliche Teile des Repertoires ohne Mutation sein, während andere über sehr viele Mutationen verfügen. Eine weitere Verkleinerung der effektiven Größe des Repertoires ist die Folge.

Die Methode der ortsspezifische Zufallsmutagenese ermöglicht zwar, viele der oben angegebenen Probleme zu umgehen, jedoch bleibt sie immer auf spezifische Genabschnitte beschränkt und ist damit für ortsungerichtete Zufallsmutagenese ungeeignet.

Die hier dargestellten Einschränkungen der derzeit angewandten Methoden der Zufallsmutagenese zeigen deutlich die Notwendigkeit 1.) einer einfachen Methode, die es ermöglicht, ganze Codons (unabhängig von der Zahl der Basen pro Codon) statt einzelner Nukleotide in DNA-Strängen zufälligen auszutauschen und eine definierte Zahl an Mutationen (Codonaustausche) pro DNA-Strang einzubauen und 2.) einer universellen Methode, mit der Millionen von Varianten in wenigen Stunden analysiert werden können.

An beiden Themen wird am Lehrstuhl gearbeitet.